在制作原代細(xì)胞免疫熒光時，容易出現(xiàn)一些問題，造成熒光鑒定失敗，將抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）時，一定要注意抗體的比例高低和濃度。

制作免疫熒光常用的方法有：

方法一：直接法

步驟：將熒光標(biāo)記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，經(jīng)一定的溫度和時間染色，水洗—干燥—封片—鏡檢

優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、特異性高、非特異性染色少

缺點(diǎn)：敏感性低

方法二：間接法

步驟：先用已知未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，再用標(biāo)記的抗體（二抗）與其反應(yīng)，形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，水洗—干燥—封片—鏡檢

優(yōu)點(diǎn)：敏感性強(qiáng)，目前多采用間接法

缺點(diǎn)：操作復(fù)雜

實(shí)驗(yàn)過程中常見的問題：

1，整個細(xì)胞片都出現(xiàn)熒光高點(diǎn)

原因有二：一是二抗?jié)舛冗^高，適當(dāng)降低二抗?jié)舛燃纯?。二是二抗發(fā)生沉淀，可以使用過濾或者離心熒光標(biāo)記二抗

2，信號弱或無信號，染色細(xì)胞過少

目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中沒有表達(dá)，需要制備細(xì)胞裂解液，用Western   Blotting驗(yàn)證目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中是否表達(dá)。

表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞過少，標(biāo)本中使用更多的細(xì)胞，試用其他瞬時轉(zhuǎn)染方法，或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

細(xì)胞通透性差，需要增加通透劑作用的時間或者濃度，或改用其它的通透劑

染色前的固定步驟破壞了抗原表位，改用其他固定方法。

通透使抗原丟失，可以減少通透劑作用的時間或強(qiáng)度。

抗體不識別，需要換用其他抗體

一抗稀釋度過大，使用同一樣品按*的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定*的一抗稀釋比例。

二抗選擇錯誤，要使用正確的二抗

3，鏡下觀察只有DAPI的藍(lán)光，目的熒光幾乎沒有或者很弱

出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗?jié)舛?；共聚焦的激發(fā)熒光強(qiáng)度不夠大；二抗孵育時是否是對應(yīng)的種屬，比如本來需要山羊抗鼠結(jié)果加為山羊抗兔。

4，細(xì)胞核周圍總是存在有一些藍(lán)色的小點(diǎn)點(diǎn)

這種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥2周后再檢測，或者通過提高共聚焦機(jī)器背景值來覆蓋支原體熒光

5，如何共定位的視野

共定位時，首先判斷哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)染成功的，比如我過表達(dá)了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位關(guān)系，則在視野中尋找已成功轉(zhuǎn)染蛋白A的細(xì)胞，一般熒光強(qiáng)度會顯著高于周邊其他細(xì)胞，再在這個細(xì)胞上觀察蛋白B的表達(dá)。

6，視野中細(xì)胞與細(xì)胞之間存在散在的發(fā)光點(diǎn)

有兩種情況可造成：1，拍照時PBS量過少引起的非特異性；2，PBS未過濾，未溶解的殘?jiān)じ蕉鴮?dǎo)致

三、除此之外，這些注意事項(xiàng)也要牢記

1、合適的抗體稀釋比例

通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強(qiáng)度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原，強(qiáng)烈建議濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

2、抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子

3、細(xì)胞固定和通透

為達(dá)到*的檢測效果，細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵，細(xì)胞和抗原需要保證*的結(jié)構(gòu)，并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實(shí)現(xiàn)：細(xì)胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進(jìn)行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對于核內(nèi)抗原可能無效，需要用到Triton。使用皂角苷進(jìn)行通透時，要注意它會引起細(xì)胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環(huán)節(jié)都需要進(jìn)行通透。另外，細(xì)胞可以用冰甲醇進(jìn)行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。

4、封閉條件的優(yōu)化選擇

為了防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清，一般來說，血清價(jià)格比較昂貴，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以說是的封閉血清。另外封閉時間不易過長，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的選擇

封閉過后需要一抗孵育，可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h，以筆者的經(jīng)驗(yàn)是一抗孵育4度過夜比較好，抗原抗體結(jié)合會比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據(jù)抗體說明書來，再根據(jù)自己具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。如果抗體濃度過低，會造成信號太弱，如果抗體濃度過高可能會造成背景染色太強(qiáng)。熒光二抗個人感覺Alex flour熒光基團(tuán)信號強(qiáng)于Dylight強(qiáng)于FITC。如果做免疫雙標(biāo)，一抗要來自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開。